Los investigadores aragoneses podrán a partir de ahora evaluar la eficacia de nuevos tratamientos o estudiar la respuesta inmunitaria frente a la covid-19 con coronavirus cultivados en Aragón. Adaptando protocolos de bioseguridad y coordinando equipos clínicos, técnicos y académicos, hace unas semanas se aislaron y fotografiaron, en laboratorios e instalaciones de microscopía de la Universidad de Zaragoza, los primeros SARS-CoV-2. Disponer de coronavirus humanos va a permitir avanzar y consolidar estas líneas de investigación.
Estos son los primeros SARS-CoV-2 aislados y fotografiados en Aragón.Universidad de Zaragoza
Acaba de ser aislado y caracterizado el primer coronavirus SARS-CoV-2 obtenido en un hospital de Aragón. Es el fruto del trabajo conjunto de dos servicios del SAI (Servicio General de Apoyo a la Investigación) de la Universidad de Zaragoza: el de Análisis Microbiológico y el de Microscopía Electrónica de Sistemas Biológicos.
"Nunca antes se había cultivado ni aislado un coronavirus en Aragón", destaca Julián Pardo, director de la División Biomédica del SAI. "Este aislado va a ser fundamental para poder evaluar la eficacia de los nuevos tratamientos experimentales y para poder entender mejor la respuesta inmunológica frente a esta infección utilizando modelos animales in vivo en los que nuestros equipos trabajan en la actualidad".
En realidad, si bien científicamente no supone ninguna novedad, pues "aislar el SARS-CoV-2 ya se ha hecho en muchos laboratorios –precisa Pardo–, sin embargo, haber aislado en Aragón el primer virus de estas características nos va a permitir tener más libertad y competitividad para investigar esta enfermedad sin depender de acuerdos con otras entidades". Antes, prosigue, "no había ninguna línea de investigación con coronavirus humanos en Aragón. Por tanto, no infectábamos animales". Ahora, los coronavirus cultivados podrán utilizarse para infectar a los animales de experimentación con el fin de estudiar la inmunidad frente a coronavirus y nuevos tratamientos.
A crecer
Los coronavirus crecen ya en células de mono (células Vero) para pasar posteriormente al medio de cultivo. Con estos SARS-CoV-2 ‘de cultivo propio’ podrán los investigadores aragoneses experimentar, en proyectos de colaboración en los que participan los equipos del propio Julián Pardo, investigador Araid del Instituto de Investigación Sanitaria Aragón (IIS Aragón); Rafael Benito, del Servicio de Microbiología del Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa/IIS Aragón; José Ramón Paño, del Servicio de Enfermedades Infecciosas del mismo hospital; y Eva Gálvez, del Instituto de Carboquímica (ICB-CSIC).
El proceso desde obtener la muestra hasta la toma de imágenes el pasado 20 de mayo se completó en algo más de dos semanas, pero hizo falta una fundamental etapa previa, que comenzó el 24 de abril, para formar y entrenar a todo el personal implicado, así como adaptar e implementar nuevos protocolos de bioseguridad. Originalmente, se trabaja con virus reales sin inactivar que, además, se cultivan para que se multipliquen. Únicamente para tomar las fotografías al microscopio electrónico, una vez aislados y procesados, se inactiva la muestra.
El Servicio de Análisis Microbiológico trabajó, junto al Comité de Bioseguridad de la Universidad de Zaragoza y la Unidad de Prevención de Riesgos Laborales, en la adecuación de los procedimientos de uso del laboratorio para que todos los usuarios pudieran trabajar sin interferirse ni exponerse a riesgos, así como en la adecuación de los equipos de protección.
Haber puesto a punto estos nuevos protocolos de trabajo va a servir además, señala Pardo, para que desde el Servicio de Análisis Microbiológico "se pueda dar apoyo a otros proyectos que trabajen en esta línea, algo que antes no era posible". Esto va a suponer también "la consolidación de una nueva línea de investigación en Aragón centrada en el estudio inmunológico de la infección por SARS-CoV-2".
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Bajo el microscopio electrónico
Incluso se llegan a apreciar las espículas características de los coronavirus. Estos son los primeros SARS-CoV-2 aislados y fotografiados en Aragón. En las imágenes se observan las células Vero (una línea celular de experimentación de riñón de mono) con virus en su interior o saliendo de ellas. Se han fotografiado mediante un microscopio electrónico de transmisión, que utiliza como fuente de iluminación un haz de electrones acelerado mediante alto voltaje. Ver muestras biológicas en estos equipos no es nada fácil. "Para hacerlas visibles es preciso procesarlas previamente", explica María José Marín, técnico del Servicio de Microscopía Electrónica de Sistemas Biológicos del SAI. Para ello "se emplean compuestos con elementos de mayor peso atómico que se fijan a las membranas, ácidos nucleicos y cadenas proteínicas presentes en las células, porque, si no, dado su bajo peso molecular, no serían visibles, pues los electrones atravesarían la muestra sin mostrar apenas diferencia de contraste en la imagen entre las distintas regiones".
Así se aisló el primer SARS-CoV-2 en Aragón
"Unos desde dentro del laboratorio, directamente con el material, pipetas, contenedores, y otros desde fuera, ‘vigilando’ el correcto uso de los equipos de protección. Entre todos compusimos el equipo de primer ataque al virus", relata Carmen Lafoz, responsable técnica del Servicio de Análisis Microbiológico que ha velado por los protocolos de bioseguridad. Esenciales, porque "un mal uso, a la hora de ponerse o quitarse un mono de protección, unos guantes, puede hacer que se produzca un ‘escape’ al exterior o una contaminación del investigador. Éramos ‘todo ojos’", señala.
Iratxe Uranga (IIS Aragón), Maykel Arias (ICB) y Eduardo Moneo (Unizar), componen junto a Santiago Uranga el equipo que ha aislado los primeros coronavirus en Aragón.S. U.
Tuvieron que realizar "mucho trabajo de adaptación, para poder coordinar el trabajo de distintos grupos de investigación con agentes patógenos diferentes –indica Lafoz–. Lo demás fue como componer un puzle para ajustar espacios y horarios a la hora del trabajo. Conseguimos que todos se sintieran seguros y el trabajo salió adelante".
El virus fue finalmente aislado en el laboratorio de alta contención biológica de nivel 3 que se encuentra ubicado en la facultad de Medicina por el equipo formado por Iratxe Uranga (IIS Aragón), Maykel Arias (ICB-CSIC) y Eduardo Moneo y Santiago Uranga (Unizar).
El punto de partida fue una muestra nasofaríngea de un paciente covid-19 proporcionada por el Servicio de Microbiología del hospital Clínico. Este fue, paso a paso, el proceso seguido para aislar, caracterizar y finalmente poner en cultivo el coronavirus SARS-CoV-2:
1-El primer paso es separar el virus de otros microorganismos, moco, fluidos y restos celulares de la propia muestra para obtener un cultivo puro con el que poder trabajar.
2-Una vez obtenido el virus, se toman fotos al microscopio electrónico para ver que, efectivamente, es un virus y se hace una caracterización mediante PCR para confirmar que se trata de SARS-CoV-2 y no otro virus.
3-Para evitar que crezcan bacterias y hongos, hay que aislarlo, utilizando antibióticos y antifúngicos.
4-Se filtra para eliminar restos celulares y se pone en cultivo con células Vero. Esta línea celular para investigación está compuesta por células de riñón de mono; se utilizan porque se infectan fácilmente con este coronavirus. "De este modo el virus crece y, al cabo de tres días, cuando ya empieza a matar a las células –explica Julián Pardo–, se libera al medio de cultivo y de allí se enriquece mediante filtración".