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Tercer Milenio

Crispr: una década modificando genomas

Con el nombre Crispr-Cas se conoce a un conjunto de herramientas que podríamos describir como ‘tijeras genéticas’ que cortan la molécula de ADN en posiciones concretas del genoma y permiten introducir en ellas modificaciones precisas. La versatilidad de Crispr, descubierta hace una década, ha revolucionado la edición de los genomas de animales, plantas y microorganismos, y ya se aplica para desarrollar terapias muy específicas para algunas enfermedades.

Las herramientas Crispr son capaces de cortar el ADN con gran precisión.
Las herramientas Crispr son capaces de cortar el ADN con gran precisión.
NIH Image Gallery / Bethesda, Maryland, USA

Desde hace más de una década, científicos de todo el mundo diseñan herramientas moleculares con las que modificar a voluntad los genomas de animales, plantas y microorganismos de forma precisa. Es la denominada ‘edición del genoma’, y entre sus aplicaciones, presentes y futuras, se encuentra la cura de enfermedades o la obtención de variedades de animales y plantas con características mejoradas.

Para desarrollar estas herramientas, los científicos se fijaron en mecanismos presentes en la naturaleza y los fueron adaptando a su conveniencia. Primero identificaron proteínas con capacidad de unirse al ADN y las manipularon mediante técnicas de ingeniería genética para que reconocieran las secuencias de ADN deseadas. Después, las fusionaron con otras proteínas (denominadas nucleasas) que poseen la facultad de cortar el ADN en ambas cadenas; una especie de tijeras genéticas.

Y, finalmente, para editar los genomas a voluntad, se dieron cuenta de que podían aprovechar los mecanismos con los que las células reparan rápidamente este tipo de roturas muy dañinas. Por ejemplo, si junto con las herramientas de edición se introduce un fragmento de ADN con la secuencia silvestre (que no contiene la mutación), la célula lo utilizará para reparar el corte y reemplazar la secuencia mutada por la correcta. Este sistema también sirve para añadir nueva información.

Sin un ADN molde, en cambio, los mecanismos de reparación celular, que son propensos a error, incorporan o eliminan a menudo unas pocas letras en el punto de empalme (mutaciones conocidas como ‘indels’). En 2008, tres equipos de investigación aprovecharon estas mutaciones para silenciar la función de genes en células en cultivo. Un año más tarde, se logró lo mismo en ratas de laboratorio, y más tarde, en otros animales modelo y en ganado.

No obstante, dos de las primeras herramientas de edición genómica desarrolladas, las nucleasas con dedos de zinc y las Talen, eran poco versátiles, ya que, para cada secuencia que se desea editar, se debe modificar el módulo de la proteína que se une al ADN; y esto es costoso.

Simple y extremadamente eficaz

En búsqueda de alternativas más fácilmente programables, los científicos se fijaron en un mecanismo con el que las bacterias y las arqueas hacen frente a las infecciones víricas. El sistema, denominado Crispr-Cas9, consta de dos elementos: una molécula pequeña de ácido ribonucleico (ARN guía), que es la que reconoce la secuencia de ADN diana, y una enzima endonucleasa (Cas9) con capacidad de cortar el ADN de forma específica, donde se lo indique la pequeña molécula de ARN guía. Las bacterias, con este sistema, reconocen y destruyen el ADN de virus atacantes.

En 2012, las investigadoras Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna reconocieron el potencial de Crispr-Cas9 y demostraron que podía utilizarse para la edición de genomas. Consiguieron reconstituir el sistema en el laboratorio y programarlo para dirigirlo específicamente no contra el ADN de un virus, sino contra secuencias diana de los genomas de otras especies. Simplemente modificando la corta secuencia del ARN guía, se podía dirigir Cas9 (las ‘tijeras’) a cualquier punto del genoma que se quisiera editar. El método era mucho más rápido, barato, eficiente y versátil que otras técnicas de edición. Y permitía modificar varios genes a la vez. En 2013, los laboratorios de Doudna y de Feng Zhang y George Church, adaptaron el sistema para editar células humanas, y el equipo de Rudolf Jaenisch lo empleó para generar ratones con múltiples genes silenciados.

Desde entonces, se han desarrollado variantes con enzimas Cas9 más pequeñas que pueden empaquetarse en los vectores de terapia génica (generalmente virus modificados) y también otras versiones con mayor fidelidad para evitar que se produzcan modificaciones en sitios no deseados del genoma, una de las limitaciones de Crispr. Se ha desarrollado también una nueva generación de herramientas de edición como los editores de bases, o los editores de calidad, que solo cortan una cadena de ADN, con el fin de minimizar la introducción de cambios no deseados. Por su elevada especificidad, estos editores tienen un gran potencial de aplicación clínica.

Crispr-Cas9 ha revolucionado completamente la edición genómica. En la última década se ha empleado para modificar prácticamente todos los organismos modelo que los científicos estudian para entender cómo funcionan los procesos biológicos y también tiene múltiples aplicaciones en agricultura, ganadería y, especialmente, en salud humana, como veremos en los próximos años.

Terapias basadas en Crispr

Durante prácticamente una década, las herramientas Crispr han estado encerradas en el laboratorio, donde se han ido perfeccionando, y se han empleado para estudiar enfermedades. Por ejemplo, se usan de forma rutinaria en células en cultivo y en animales modelo para silenciar genes y analizar qué ocurre cuando estos dejan de funcionar. No obstante, en los últimos años se han diseñado las primeras terapias basadas en Crispr-Cas9 y se han empezado a ensayar en pacientes.

Entre estas se encuentran las terapias de dos enfermedades hereditarias de la sangre: la anemia de células falciformes y la beta-talasemia. Ambas enfermedades están causadas por mutaciones en el gen de la cadena beta de la hemoglobina, la proteína encargada de transportar oxígeno en los glóbulos rojos. Los pacientes con las formas más graves de estas enfermedades necesitan frecuentes transfusiones sanguíneas y pueden presentar complicaciones en distintos órganos.

En 2019, en el marco de un ensayo clínico, se trató a los primeros pacientes con una innovadora terapia que emplea Crispr para reactivar la producción de hemoglobina fetal y así compensar el déficit de hemoglobina beta en los pacientes. Los médicos les extrajeron células de la médula ósea y realizaron la edición ‘ex vivo’ (fuera del cuerpo de los pacientes). Después, se les sometió a quimioterapia para destruir la mayor parte de células de su médula y se les inyectaron células editadas (millones de ellas) para reemplazarlas. El tratamiento fue efectivo y, años después, los pacientes siguen sin necesitar transfusiones de sangre. Parece que Crispr los ha curado.

Esta aproximación ‘ex vivo’ también se está ensayando en algunos tipos de cáncer, modificando células del sistema inmunitario –los linfocitos T– para ayudar a que reconozcan los tumores o en enfermedades autoinmunes para que no se dirijan contra las células del propio cuerpo.

Otras se administran directamente a los pacientes. Son las terapias ‘in vivo’, como en el caso de la amiloidosis por transtiretina (TTR). Esta enfermedad infiltrativa, grave y progresiva, está causada por mutaciones en el gen TTR que hacen que la proteína TTR se pliegue incorrectamente y forme depósitos que interfieren con la función del corazón y del sistema nervioso. La terapia Crispr bloquea la producción de TTR para detener la progresión de la enfermedad o incluso revertirla. En este caso se administró por vía sanguínea (protegida en nanopartículas lipídicas) para dirigirla al hígado, órgano donde se produce la TTR. La terapia es segura y, en varios pacientes, redujo la fabricación de TTR más de un 80%.

La edición ‘in vivo’ se está ensayando también para tratar un tipo de ceguera hereditaria, la amaurosis congénita de Leber, en la que Crispr se administra directamente en la retina con la ayuda de un virus modificado.

Crispr se está estudiando también para bloquear genes esenciales para la multiplicación de los virus o, en el caso del VIH, para atacar el virus en su forma latente, dentro de los linfocitos T CD4+, uno de los reservorios celulares donde persiste, y que constituye la barrera principal para una cura definitiva.

Polémica edición de embriones

A finales de 2018, Crispr ocupó los titulares de la prensa mundial cuando el investigador chino He Jiankui afirmó haber empleado la edición genómica para desactivar el gen CCR5 en embriones humanos, que más tarde fueron implantados a dos mujeres. Este gen codifica una proteína que el virus del sida utiliza como puerta de entrada para infectar las células. Con su inactivación, el investigador pretendía hacer resistentes al VIH a las bebés resultantes, hijas de padres seropositivos. En humanos se han identificado individuos portadores de una mutación (deleción) en las dos copias del gen CCR5, que les confiere resistencia a la infección por VIH, incluso después de repetidas exposiciones al virus. Aunque también se han descrito casos aislados de seropositividad.

He Jiankui cruzó un límite ético porque la edición genética en embriones implica abrir la puerta a que los cambios introducidos puedan transmitirse a las generaciones futuras. También porque las herramientas de edición empleadas pueden introducir cambios no deseados en otros puntos del genoma. Del primer embarazo nacieron dos niñas, una de ellas con las dos copias del gen CCR5 editadas y su hermana con solo una copia modificada (al igual que la niña nacida en el otro embarazo). En una de las gemelas se detectó una alteración no deseada, pero se desconoce los efectos a largo plazo que esta, u otras que hayan pasado inadvertidas, podrían tener para su salud. La edición en embriones también puede resultar en individuos mosaico, con una mezcla de células modificadas y otras que no (o con distintas modificaciones). Por ello, los científicos alertan sobre este tipo de prácticas y la Organización Mundial de la Salud estableció un comité global de expertos para examinar los desafíos científicos, éticos, sociales y legales asociados con la edición del genoma humano.

Paternidad múltiple de Crispr

Las siglas Crispr designan unas secuencias repetitivas de ADN presentes habitualmente en microorganismos procariotas. A finales de los años 80, ya se habían observado en la bacteria Escherichia coli, pero no fue hasta el 2000 cuando el microbiólogo español Francisco Mojica de la Universidad de Alicante y su equipo identificaron su presencia en muchas otras bacterias y en prácticamente todas las arqueas. En 2005, Mojica fue el primero en sugerir que las Crispr forman parte de un sistema, evolucionado durante millones de años, que proporciona protección a las bacterias frente a las infecciones víricas, dos años antes de que se demostrase su papel como mecanismo de resistencia adquirida.

Las bacterias incorporan en su genoma pequeños fragmentos del ADN de los virus que las han infectado y, de este modo, los ‘recuerdan’. Posteriormente, en futuras infecciones, utilizarán las Crispr para detectar el ADN de virus similares y la enzima Cas9 (una especie de tijeras genéticas) para destruirlos. Mojica acuñó el término Crispr (acrónimo de Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas).

El reconocimiento de su potencial como metodología para modificar los genomas se lo debemos a la microbióloga y genetista francesa Emmanuelle Charpentier y a la bioquímica americana Jennifer Doudna, que en 2020 fueron laureadas con el Premio Nobel de Química. Aún así, Crispr y la edición genómica tienen múltiples padres.

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